2020 旭硝子財団 助成研究発表会 要旨集
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とから、恐らく、クローニングする遺伝子の数が増えると遺伝子の並び順が影響する可能性があり、3つ以下であれば、さほど考慮する必要がないことが推察される.同様の現象は、別経路でも観察されているが、ベクターあたりの遺伝子数を3つ以下に抑えるのは難しく、個々の並び順の検討が必要となると考えられた. 2.3グルコースからのモルヒネ生産 遺伝子の並び順や酵素の最適化を試み、モルヒネ生産菌を構築したが、モルヒネは作られなかった.更には、(S)-レチクリン生産菌にDRSを入れただけで(R,S)-レチクリンの生産量は著しく低下したことから、大腸菌に導入する遺伝子数が多いと、互いの遺伝子発現を干渉しあう可能性が考えられた.実際、チロシン生産系ゲノム挿入株にpET23a空ベクターを導入しただけでチロシン生産能は半分以下になってしまう(図2).また、T7プロモーターを持たないpET23a(pET23aΔpT7)を導入した株では生産の低下が殆ど見られなかったことからも、発現負荷による生産能低下が一因であると考えられた.そこで、発現負荷低減のため、モルヒネ生産系をグルコースから(S)-レチクリン生産系、(S)-レチクリン生産からサルタリジン生産系、サルタリジンからモルヒネ生産系の3つに分け、3菌体を段階的に培養し、それぞれの培養液を次の菌体の培養に用いる手法により、グルコースからのモルヒネ生産を試みた.その結果、1段階目でグルコースからおよそ490 μMの(S)-レチクリン生産培養液を回収し、当量のサルタリジン生産菌培養液を混ぜ、189 μMのサルタリジン含有液を得た.更にモルヒネ生産菌をサルタリジン含有培地で培養したところ、48 μMのモルヒネが検出された(図4).3菌体を用いながらも、グルコースからモルヒネの直接発酵に世界で初めて成功した.しかし、実用生産において、段階的に複数の菌株を培養することは、コストがかさむため、今後、1菌体での生産系構築が必須である.今回示していないが、発現負荷が菌体活性を弱めているデータも得られており、こうした多段階酵素反応系構築における問題点をいくつか列挙することができた.今後、そのような問題点を解決することにより、実用生産系の構築を目指す. 3. 今後の展開 高発現する酵素遺伝子を多く持つと互いに干渉しあい、生産が阻害される可能性が示唆された.また、プラスミドベースでの生産系は、高価な抗生物質が必要となり、実用生産には不利である.よって、今後、生合成遺伝子群をゲノムに挿入することによって、発現負荷の低減や抗生物質を用いない系を実現したい.現在のところ、プラスミドベースでは無理であったサルタリジンの1菌体での生産に成功している.また、遺伝子並べる数や並び順が重要であるが、そのメカニズムは分かっておらず、今後の課題である.こうしたノウハウは、モルヒネ生産系のみならず、多くの遺伝子を発現させる系に応用でき、合成生物学における重要な知見に結びつくと考えられる.今後はゲノムベースでの生産菌を構築し、上記に示した問題点の原因追求及びその改善法を開発し、実用化を目指したい. 4. 参考文献 1) Yang D. et al., Trend in Biotech, 2019, pii: S0167-7799(19)30277-X 2) Matsumura E. et al., Sci Rep, 2018, 7980 5. 連絡先 住所:石川県野々市市末松1-308石川県立大学生物資源工学研究所 TEL:076-227-7513 E-mail:reticuline@gmail.com 1つのプラスミド2.335.620.44.28.2HHeemmSSaallSSHHeemmSSaallSSHHeemmSSaallSSHHeemmSSaallSSHHeemmSSaallSSHHeemmSSaallSS2.7DDRRRRDDRRSSDDRRRRDDRRSSDDRRRRDDRRSSDDRRRRDDRRSSDDRRRRDDRRSSDDRRRRDDRRSS1番後ろの遺伝子を別のプラスミドに入れたとき50.231.160.2ND48.1ND図3遺伝子の並び順及び別プラスミドに遺伝子を移した場合の生産量(数値はMSのシグナル強度、ND:notdetermined)Glucose(S)-レチクリン(480 μM)サルタリジン生産菌モルヒネ(48 μM)(S)-レチクリン生産菌モルヒネ生産菌培養上清培養上清モルヒネ標品生成物MS/MS pattern図43菌体を段階的に培養することによるグルコースからのモルヒネ生産サルタリジン(189 μM)図3遺伝子の並び順の生産量に対する影響(数値はMSにおけるシグナル強度、ND:not determined) 図4 3菌体を用いたグルコースからのモルヒネ生産 −87−

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